Biochemie - Laboratorní důkazy drog

1.Chromatografie

Nejprve z historie vniku této metody.

Na počátku 50.let byla běžnou metodou ke kontrole jakosti tinktur a extraktů vyrobených v lékárnách tzv.kapilární analýza. Zkoumaná tinktura se nalila do malého kalíšku, do ní se zavěsil proužek čistého filtračního papíru a vše se zavřelo do neprodyšné skříňky, aby se zabránilo odpařování.Tekutina se nasávala vzhůru a strhávala s sebou rozpuštěné rostlinné látky.Ty se usazovali v různých vzdálenostech od hladiny v kalíšku a tak se získal kapilogram.

K podobnému způsobu dělení se vědci vrátili a nyní jej používají velmi hojně ve všech odvětvích chemie, biologie aj.

Chromatografie je analytická metoda, která umožňuje oddělit ze směsi látek její jednotlivé složky. Má mezi ostatními analytickými metodami zcela jiné postavení. Dovoluje stanovit stovky látek v jediném vzorku o hmotnosti jen 0,001g a oddělit je od sebe bez narušení , když jsou ve zkoumané látce přítomny v množství jen 10 ^–12 g tedy v množství miliontiny miliontiny gramu. Jen díky chromatografické analýze se podařilo odhalit složení mnoha životně důležitých látek, jako jsou vitamíny a hormony, izolovat z léčivých rostlin účinné složky a na základě jejich analýzy je vyrábět uměle. 53858sux27qbi4j

Pro naše účely nám stačí podrobněji rozebrat papírovou chromatografii.

Papírová rozdělovací chromatografie

Papírová chromatografie patří k nejmodernějším analytickým metodám.

Naneseme na tužkou předem označené místo proužku papíru nepatrné množství analyzovaného roztoku a po vysušení papír zavěsíme do nádoby nasycené vodními parami tak, aby jeho dolní část zasahovala do vhodného rozpouštědla.Rozpouštědlo začne vzlínat a bude s sebou unášet i analyzovanou směs, jejíž jednotlivé složky se v závislosti na větší či menší rozpustnosti postupně oddělí.Vytvoří se skvrny a tak vznikne chromatogram. ub858s3527qbbi

Poměr vzdálenosti čela rozpouštědla od startu a vzdálenosti středu skvrny od startu je pro určité látky konstantní.

Popsaný způsob uspořádání papírové chromatografie se nazývá přesněji jednorozměrná vzestupná papírová chromatografie, protože rozpouštědlo postupuje jedním směrem a to zdola nahoru.

Při jiném uspořádání mluvíme o jednorozměrné sestupné papírové chromatografii, rozpouštědlo prosakuje papírem shora dolů.

Často se používá i tzv.dvojrozměrná papírová chromatografie, jejíž princip spočívá v tom, že analyzovaný vzorek chromatografujeme dvěma různými rozpouštědly, nejdříve jedním směrem a po vysušení druhým směrem kolmým na směr první.

Barevné látky můžeme sledovat při dělení snadno.Ale co když jsou nebarevné? Tady si musíme pomoci reakcemi kvalitativní analytické chemie.Nejprve chromatogram vysušíme.Víme, že některé látky spolu navzájem reagují, dávají sraženiny či různé barevné reakce.Tak např. antrachinony reagují se zásadami červeným zbarvením.Třísloviny dávají s chloridem železitým FeCl₃ modročerné až zelenočerné zbarvení.Tomuto odkrývání neviditelného se říká detekce.

Na její použití je nejjednodušší použít skleněnou tyčinku, kterou namočenou ve zkoumadle, přejedeme po délce chromatogramu.V místech, kde jsou látky reagující se zkoumadlem, se objeví příslušné barevné skvrny.Některé látky jsou zjistitelné bez použití zkoumadel.Stačí je vložit pod zdroj ultrafialových paprsků, pod nímž se objeví mnohé látky jako zářivé skvrny.

Použití

Tento způsob dělení směsí je velmi jednoduchý, protože nevyžaduje nákladná zařízení.Stačí k němu odměrné válce asi 250 ml až 500 ml objemu, proto ho můžeme použít i ve školní laboratoři.Extrakt či směs látek se nanáší přímo na papír, asi 2 cm od konce proužku.Proužek musí mít délku válce.Vezmeme-li širší papír, můžeme nanášet více skvrn vedle sebe ( odstup asi 3 cm ).Papír potom svineme do jednoduché role, spojíme nepřekrývající se konce nití a vložíme do odměrného válce na jejímž dně je rozpouštědlo.Tento způsob má výhodu, že můžeme provádět současně více dělení a za stejných podmínek.Můžeme též nanášet vedle sebe různá množství extraktu (např.na 1. start 1 kapku, na 2.start 2 kapky až 4-5 kapek ).Při větších množstvích se sice tvoří šmouhy, ale mohou se objevit i látky, které jsou v malých nanáškách nezjistitelné.

Dolní konec papíru musí sahat 0,5 – 1 cm do rozpouštědla na dně válce (stačí asi 10 ml).Skvrna na startu musí být nad hladinou, aby se nerozmývala do rozpouštědla.Válcem během dělení nehýbáme.Teplota prostoru, v němž dělení provádíme, má být asi kolem 20°C.

Pro tuto chromatografii se používá speciální chromatografický papír z velmi čisté celulózy, nebo filtrační papír.

Detekci se provádí různými činidly,UV či infračerveným světlem.

Plynová chromatografie

Základem této metody je chromatografická kolona tvořená kapilárou, jejíž vnitřní stěny jsou pokryty tuhým adsorbentem nebo vrstvičkou málo těkavé kapaliny.Tato metoda patří k nejcitlivějším analytickým metodám.Je to nejvýhodnější metoda k stanovení těkavých látek typu toluen, aceton, etanol, benzín, trichlorethylen, atd.

Chromatografie na tenkých vrstvách

Metoda nejčastěji užívaná pro potřeby screeningu.Je málo náročná na čas i přístrojové vybavení.Proces rozdělení směsi látek probíhá ve vrstvě práškového sorbentu představujícího stacionární fázi, kterou prolíná mobilní kapalná fáze.Jednotlivéoddělené složky se pak detegujírůznými činidly, UV či infračerveným světlem.Pro zlepšení rozlišovací složky užijeme více sorbentů, mobilních fází spolu se standardními látkami a různými chemickými, fyzikálními či fyzikálně chemickými metodami detekce, které vyvolávají barevné odlišení látek.Jako sorbentu se užívá silikagel, oxid hlinitý a celulosový prášek.Klasickým případem užití je všeobecný screening, např.u psychofarmak(neuroleptika a inhibitory monoaminoxidázy).

2.Fotometrie

Fotometrické metody – fotokolorimetrie, spektrometrie, spektrofotometrie. Využívá se krystalové křemenné optiky a fyzikálních odlišností látek v UV světle či v infračerveném či fluorescentním emisním spektru. Spektrometrie je optická metoda zahrnující měření světelné absorpce v úzké oblasti monochromatického záření (UV nebo infračervené).Při měření vychází záření z vhodného zdroje, prochází monochromatem, který odděluje záření úzkého svazku vlnových délek.Záření prochází vzorkem v kyvetě a je zaznamenáno fotobuňkou, kde se energie světelná promění v energii elektrickou a je registrována.Sestavuje pak absorpční křivky, specifické pro různé látky.Touto metodou detekujeme LSD, kodein, heroin, a to s velkou přesností.

3. Hmotová spektrometrie

Jedná se o nejpřesnější analytickou metodu vůbec.Je prakticky universální, co se týče sledovaných látek i odebraného materiálu.Pracujeme s přesností molekulových hmotností a s uvedenou rozlišovací schopností.Tento metodika je často kombinována s dalšími detekčními metodami (zúžení spektra hledaných látek).Nevýhodou metody je přílišná náročnost na přístrojové vybavení.

4. Imunochemické metody

Využívají antigenních vlastností cizorodých látek, které reagují se standardními enzymy získanými ze senzibilovaných zvířat.Detekce změny aktivity enzymu se provádí pomocí radioimunoanalýzy (RIA).

Některá analytická a toxikologická data nejběžněji zneužívaných drog